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蛋白質(zhì)含量測定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。其中Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復雜，但較準確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標準蛋白質(zhì)。下面就來(lái)進(jìn)行了解一下這四種蛋白質(zhì)測量方法：

定氮法使用KDN系列定氮儀、全自動(dòng)定氮儀、自動(dòng)定氮儀、或者是半自動(dòng)定氮儀來(lái)進(jìn)行測量，采用的原理是：樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下：

NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)

2NH3 +H2 SO4 ――(NH4 )2 SO4 (2)

(NH4 )2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)

反應（1）、(2)在凱氏瓶?jì)韧瓿�，反應�?）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。

為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實(shí)驗和計算方法這里從略。

計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。

二、雙縮脲法（biuret法）

實(shí)驗原理：雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò )合物，稱(chēng)為雙縮脲反應。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡(luò )合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。

試劑與器材

試劑：（1）標準蛋白質(zhì)溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白（bsa）或標準酪蛋白，配制成10mg/ml的標準蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來(lái)校正其純度。如有需要，標準蛋白質(zhì)還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱(chēng)量配制成標準蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。（2）雙縮脲試劑：稱(chēng)以1.50克硫酸銅（CuSO4•5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6•4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(cháng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現，則需要重新配制。

器材：可見(jiàn)光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。

操作方法：1.標準曲線(xiàn)的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標準蛋白質(zhì)溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25℃）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線(xiàn)。

2、樣品的測定：取2～3個(gè)試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過(guò)10mg/ml。

三、Folin—酚試劑法（Lowry法）

實(shí)驗原理：

這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現在已可以訂購），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結合生成復合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應用。這個(gè)測定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費時(shí)間較長(cháng)，要精確控制操作時(shí)間，標準曲線(xiàn)也不是嚴格的直線(xiàn)形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線(xiàn)。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì )色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

進(jìn)行測定時(shí)，加F olin—酚試劑時(shí)要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發(fā)生，故當Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發(fā)生。

此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。

此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。

試劑與器材：

1.試劑：（1）試劑甲：（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6•4H2O）。溶解于500毫升蒸餾水中。（B）0.5克硫酸銅（CuSO4•5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。

（2）試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（Na2WO4•2H2O）,25克鉬酸鈉（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結束時(shí)，加入150克硫酸鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數滴液體溴，開(kāi)口繼續沸騰15分鐘，以便驅除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋?zhuān)�約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。（3）標準蛋白質(zhì)溶液:

精確稱(chēng)取結晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。

2.器材：（1）可見(jiàn)光分光光度計（2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管16支

操作方法：1.標準曲線(xiàn)的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標準蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì )使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線(xiàn)。

注意：因Lowry反應的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開(kāi)始計時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開(kāi)始測定光吸收。每分鐘測一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗記錄本上預先畫(huà)好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的吸光度值。

2.樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線(xiàn)的測定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標準曲線(xiàn)測定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。

根據所測樣品的吸光度值，在標準曲線(xiàn)上查出相應的蛋白質(zhì)量，從而計算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。

四、紫外吸收法

原理：由于蛋白質(zhì)中存在著(zhù)含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，它們具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280nm波長(cháng)處，且在此波長(cháng)內吸收峰的光密度值OD280nm與其濃度成正比關(guān)系，故可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據。

本法操作簡(jiǎn)便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化之蛋白質(zhì)的微量測定。主要缺點(diǎn)：1.當待測的蛋白質(zhì)與標準蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量差異較大時(shí)，則產(chǎn)生—定誤差（故要準確定量，必需要有待測蛋白質(zhì)的純品作為標準來(lái)比較，或且已經(jīng)知道其消光系數作為參考），2. 不少雜質(zhì)在280nm波長(cháng)下也有—定吸收能力，可能發(fā)生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm，因此溶液中同時(shí)存在核酸(嘌呤、嘧啶等吸收紫外線(xiàn))時(shí)，必須同時(shí)測定OD260nm與OD280nm�；煊泻怂釙r(shí)必須分別測定280nm和260nm兩處的OD值，，然后根據兩種波長(cháng)的吸收度的比值，通過(guò)經(jīng)驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實(shí)含量，再按公式推算蛋白質(zhì)含量。

三、 實(shí)驗材料、主要儀器和試劑

試驗材料：待測的蛋白質(zhì)溶液。

主要儀器：（1）紫外分光光度計，（2）試管與試管架，（3）刻度吸量管

試劑:（1）1mg/mL標準牛血清蛋白溶液(BSA)：準確稱(chēng)取1mg經(jīng)凱氏定氮法校正的BSA標準品，溶于1mL水，室溫穩定2小時(shí)，12,000g離心10min（—20℃ 保存6—8月，—80℃ 保存1年）。

（凱氏定氮法測定原理：凱氏氮指的是將所有樣品中有機氮和無(wú)機氮全部轉換為無(wú)機氮(氨)，并測試的過(guò)程。蛋白質(zhì)的含氮量較為恒定，平均為16%；即1克氮相當于6.25克蛋白質(zhì)。因此只要測定樣品中的含氮量，既可推算出樣品中的蛋白含量�；�于本方法的相對準確性，至今凱氏定氮法仍然是建立各個(gè)具體方法時(shí)采用的參考標準方法。但由于本法過(guò)于繁瑣，且不少蛋白質(zhì)的含氮量并非16%，故臨床上現已基本廢棄不用。）（2）待測蛋白質(zhì)溶液：濃度為1mg/mL左右的溶液。

四、操作步驟

1．標準曲線(xiàn)制作

按表1分別向每支試管內加入各種試劑，混勻。以光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長(cháng)處測定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪出標準曲線(xiàn)。

管號	標準蛋白質(zhì)溶（mL）	蒸餾水（mL）	蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）	OD280nm
1	0	4	0
2	0.5	3.5	0.125
3	1.0	3.0	0.25
4	1.5	2.5	0.375
5	2.0	2.0	0.50
6	2.5	1.5	0.625
7	3.0	1.0	0.75
8	4.0	0	1.0